基因工程工具酶之選擇在直接層面上決定著實(shí)驗(yàn)的成功或者失敗，然而眾多學(xué)生乃至研究人員都沒辦法搞清楚限制酶以及連接酶的正確使用方法，本文會(huì)從高考真題著手，幫助你在完全意義上理清這些容易產(chǎn)生混淆的知識(shí)要點(diǎn)。

限制酶的來源與特性

限制酶大多源自原核生物，這屬于基因工程的基礎(chǔ)常識(shí)范疇。原核生物生成限制酶的意圖是切斷入侵的外源DNA，以此捍衛(wèi)自身免受噬菌體等的侵?jǐn)_。然而有人存有疑問：既然具備切割外源DNA的能力，那么是否也會(huì)將自身的DNA切斷呢？事實(shí)上，原核生物自身的DNA對(duì)應(yīng)的識(shí)別序列平素會(huì)被甲基化修飾，進(jìn)而防止被切割。

2020年，全國高三通過課時(shí)練習(xí)發(fā)現(xiàn)，有道題目清楚表明，限制酶沒辦法切割煙草花葉病毒的核酸，原因在于煙草花葉病毒屬于RNA病毒，而限制酶僅僅能夠識(shí)別并切割雙鏈DNA的特定序列。這充分說明，酶的專一性不但在序列識(shí)別方面有所體現(xiàn)，而且在對(duì)底物類型的選擇上得以體現(xiàn)。

限制酶的切割方式

有那么一種限制酶，它能夠識(shí)別GAATTC序列，接著會(huì)在G和A之間進(jìn)行切開操作，這實(shí)實(shí)在在地是運(yùn)用了酶所具有的專一性。每一種限制酶都存在特定的識(shí)別序列以及切割位點(diǎn)，這種情況就如同鑰匙與鎖之間的那種關(guān)系。EcoRⅠ這種酶特別地就是識(shí)別GAATTC序列，在G和A之間實(shí)施切割行為，進(jìn)而產(chǎn)生黏性末端。

各不相同的限制酶切割之后所產(chǎn)生的末端也是不一樣的，存在著有的會(huì)產(chǎn)生黏性末端的情況，還有的會(huì)產(chǎn)生平末端的情形。在實(shí)驗(yàn)里常常會(huì)運(yùn)用兩種不一樣的限制酶分別去切割目的基因以及運(yùn)載體，如此一來能夠避免載體自身連接，進(jìn)而提升重組效率。然而同樣需要留意的是，有時(shí)候得使用同一種限制酶來保證末端相互匹配。

DNA連接酶的作用機(jī)制

遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸連接酶于基因工程里承擔(dān)著連接脫氧核糖核酸片段的職責(zé)，它具備催化促使形成磷酸二酯鍵的能力。和脫氧核糖核酸聚合酶不一樣，連接酶沒辦法把單個(gè)核苷酸連接到鏈上面，而是將已經(jīng)配對(duì)妥當(dāng)?shù)拿撗鹾颂呛怂崞芜M(jìn)行連接。在連接黏性末端之際，連接效率一般而言比平末端要高。

在實(shí)際的應(yīng)用情形當(dāng)中，連接反應(yīng)的相關(guān)條件控制是具有非常重要意義的，倘若溫度過高的話，就會(huì)致使末端出現(xiàn)解離情況，要是溫度太過低的話，酶的活性又會(huì)呈現(xiàn)不足狀態(tài)，一般而言會(huì)選擇在大約16℃的情況下進(jìn)行過夜連接操作，如此一來既能夠確保酶的活性，又可以維持末端的穩(wěn)定配對(duì)狀態(tài)。

運(yùn)載體的必備特征

基因工程運(yùn)載體得具備幾個(gè)關(guān)鍵特征，它要能在宿主細(xì)胞里穩(wěn)定保存，還得大量復(fù)制，如此這般才可以提供足夠的目的基因拷貝，它要有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，這便于插入外源DNA，它要帶有篩選標(biāo)記，像抗性基因或者lacZ基因，以此來幫助篩選重組子。

以外源DNA插入破壞lacZ基因的情況為例，在特定培養(yǎng)基里，菌落呈現(xiàn)白色；假若是lacZ基因完整的情況，那么菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，這種藍(lán)白斑篩選屬于基因工程里常用篩選方法中的一種。載體上面的抗性基因主要功能在于篩選含有重組DNA的細(xì)胞，并非是促進(jìn)目的基因進(jìn)行表達(dá)。

目的基因的來源與導(dǎo)入

能夠作為目的基因的來源涵蓋動(dòng)物、植物以及微生物，受體細(xì)胞的來源同樣是極為廣泛的。然而，在把基因?qū)胫?，生物體所出現(xiàn)的變異類型是需要予以留意的。當(dāng)成功地把抗蟲基因?qū)氲矫藁ó?dāng)中之后所產(chǎn)生的變異屬于基因重組，并非基因突變。原因在于這是通過人為方式引入外源基因，屬于廣義的基因重組的范圍。

然而，當(dāng)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞之后，并非可能馬上就進(jìn)行表達(dá)。其必須擁有完整的表達(dá)元件，這其中涵蓋啟動(dòng)子、終止子等非編碼區(qū)域。尤其是針對(duì)那些想要在特定組織實(shí)現(xiàn)表達(dá)的基因而言，這些調(diào)控序列絕對(duì)是不可或缺的。舉例來說，要是讓基因在塊莖當(dāng)中進(jìn)行表達(dá)，那就需要與之對(duì)應(yīng)的組織特異性啟動(dòng)子。

基因工程的應(yīng)用拓展

正常基因被導(dǎo)入病人體內(nèi)，讓表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮其功能的這種做法就是基因治療，開展此治療必然會(huì)涉及轉(zhuǎn)錄以及翻譯的過程，而且借助基因工程技術(shù)也是必不可少的，乳腺生物反應(yīng)器是利用動(dòng)物乳腺來生產(chǎn)藥用蛋白的，像抗凝血酶、生長激素等都能夠通過它來生產(chǎn)，其具有成本低的特點(diǎn)，并且產(chǎn)物活性良好。

在病毒改造這方面，借助替換病毒基因里的個(gè)別氨基酸密碼子成為終止密碼子，能夠讓其沒辦法合成完整的蛋白質(zhì)，進(jìn)而制備減毒疫苗。與此同時(shí)，設(shè)計(jì)特殊的tRNA去識(shí)別這些終止密碼子，在補(bǔ)加特定的非天然氨基酸的狀況下，又能夠恢復(fù)完整蛋白的合成，這種策略在疫苗研發(fā)當(dāng)中是很有前景的。

你于學(xué)習(xí)基因工程之際，有無碰到過弄不明白限制酶切割位點(diǎn)的那一問題，歡迎于評(píng)論區(qū)去分享你的困惑，點(diǎn)贊以便讓更多人瞅見這些實(shí)用技巧！